在没有确定通路的情况下，无参转录组数据怎么筛选差异基因呢？

在未确定特定通路的情况下，通过无参转录组数据筛选差异基因需要遵循以下步骤和策略，以确保分析结果具有生物学意义和可信度。

 

一、数据预处理

1、质量控制

（1）使用工具（如FastQC）检查原始数据的质量。

（2）修剪低质量读段和接头序列（如使用Trimmomatic或cutadapt）。

 

2、无参组装和比对

（1）无参组装法：没有参考基因组时，可选择使用组装工具（如Trinity）构建转录本。

（2）比对法：将reads比对到转录本上（如HISAT2、Bowtie2）。

 

3、定量

使用工具（如featureCounts）生成用于差异表达分析的原始counts，再利用Salmon/Kallisto等工具计算标准化表达量（如TPM、FPKM和RPKM），以量化基因或转录本的表达水平。

 

4、数据标准化

为了消除测序深度和技术偏差的影响，采用标准化方法（如DESeq2的内部标准化，或edgeR的TMM方法）。

 

二、差异基因筛选

1、确定分组和设计矩阵

（1）根据实验设计定义分组（如对照组 vs 处理组）。

（2）如果没有明确的实验分组，可基于样本聚类（如主成分分析PCA或聚类分析）进行分组初步推测。

 

2、差异分析方法

（1）使用统计方法筛选

常用工具：

• DESeq2：适合有少量生物学重复的实验。
• edgeR：适合小样本量和样本差异大的数据。
• limma（voom）：对处理后的counts数据进行线性建模分析。

筛选标准：

• p值（或校正后的FDR值） < 0.05。
• |log2FoldChange| ≥ 1（倍数变化，具体阈值可根据实验需求调整）。

输出差异基因列表。

 

（2）无监督筛选策略

如果没有明确的分组，可基于表达水平或变异度筛选：

• 选取方差最大的基因（例如前500-1000个高变异基因）。
• 使用WGCNA构建共表达网络，筛选模块基因。
• 聚类样本后按组别对比表达水平。

 

三、功能注释与分析

即使未明确特定通路，也可以对差异基因进行功能注释，挖掘潜在的生物学意义。

1、基因功能注释

（1）使用BLAST或Diamond比对差异基因到参考数据库（如NR、Swiss-Prot）。

（2）使用eggNOG、InterPro或Pfam进行功能注释。

 

2、富集分析

（1）通过GO和KEGG富集分析探索潜在功能：

• GO：基因本体（如生物过程、分子功能、细胞组分）。
• KEGG：代谢和信号通路。

（2）工具推荐：ClusterProfiler、DAVID、g:Profiler。

 

3、通路或网络分析

（1）使用GSEA（基因集富集分析）挖掘预定义的基因集是否显著富集。

（2）构建PPI（蛋白互作网络），结合工具如STRING寻找关键节点。

 

四、生物学验证

筛选出潜在关键基因后，可结合以下策略进一步验证：

1、使用qRT-PCR验证关键差异基因的表达。

2、在实验设计中增加功能实验或相关通路的探索。

 

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