WB结果分子量增加了20kDa,怎么去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰
Western Blot（WB）实验中，若观察到某蛋白的分子量相比预期增加了20kDa，这可能表明该蛋白经历了翻译后修饰。为了验证这一点，你可以采取以下步骤：
一、去磷酸化验证
1.样品准备：
首先，确保你有足够的蛋白样品。
2.选择适当的磷酸酶：
通常使用碱性磷酸酶（如Lambdaprotein phosphatase）或其它专门的去磷酸化酶。
3.进行磷酸酶处理：
根据酶的说明书进行操作，通常是在特定的缓冲液中和酶一起孵育样品一段时间。
4.再次进行Western Blot：
处理后的样品再次进行WB分析。如果蛋白的分子量减少，接近其预期大小，这表明蛋白质可能经历了磷酸化修饰。
二、去糖基化验证
1.样品准备：
同样，确保有足够的蛋白样品。
2.选择去糖基化酶：
常用的去糖基化酶包括PNGase F、O-糖酸酶等，这些酶可以去除N-或O-连结的糖链。
3.进行去糖基化处理：
根据酶的说明书进行操作，通常需要在特定缓冲液中孵育样品和酶。
4.再次进行Western Blot：
处理后的样品进行WB分析。如果蛋白质分子量减少，接近其理论大小，这可能表明蛋白质经历了糖基化修饰。
在进行这些实验时，重要的是要对照实验组（未处理的样品）和阴性对照组进行比较，以确保实验结果的准确性。此外，优化实验条件对于获得可靠的结果至关重要。
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