质谱流式细胞术应用文章分析——其他疾病
除了癌症，质谱流式也可以在包括自身免疫病、病毒感染等多种疾病机制研究和免疫检测中发挥关键作用（图1）。
图1. 使用质谱流式细胞术对病人进行大规模免疫监测研究
1、自身免疫病
自身免疫性疾病的特征是对自身抗原产生病理反应，这些反应可分为自身免疫性或自身反应性，可引起多种临床疾病。这类疾病可为全身性，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）、血管炎等系统性风湿病，也可为组织或器官特异性，如内分泌和神经系统疾病，分别包括自身免疫性甲状腺炎和多发性硬化，以及其他疾病。自身免疫性疾病可为急性或慢性，可累及基本上所有器官和身体系统。
由于自身免疫病的疾病异质性水平高，并且从患者的早期治疗中获得益处，因此确定用于诊断，预后和预测成功疗法的生物标志物至关重要。免疫表型技术的进步，如质谱流式技术，引入了前所未有的细胞亚群分辨率，现在可以全面分析患者免疫系统的表型和功能细节。
对于系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE），有研究对来自9名早期系统性红斑狼疮患者、15名系统性红斑狼疮患者和14名对照组的外周血单核细胞（PBMCs）进行了3组的38-39个标记物的标记（包括：免疫分型、T细胞/单核细胞和B细胞），并进行质谱流式分析。研究发现早期SLE患者的外周辅助T细胞、滤泡辅助T（Tfh）细胞和几个Ki-67+增殖亚群（ICOS+Ki-67+CD8 T细胞、Ki-67+调节性T细胞、CD19intermediateKi-67high浆细胞和PU.1highKi-67high单核细胞）的水平增加，比早期RA患者的改变更突出（图2）。
图2. 质谱流式细胞术对不同类型样本的Tph细胞、Tfh细胞以及细胞增殖Ki-67的表征
2017年Nature上发表了关于使用质谱流式技术来研究从外周血或直接从类风湿性关节炎（RA）和脊柱关节炎患者的滑液和炎症组织中分离出来的T细胞的激活和细胞因子产生情况的研究，在类风湿因子或抗瓜氨酸肽抗体血清阳性的RA患者中，能够识别出病理上扩大的PD-1hiCXCR5negCD4pos T细胞亚群。这些细胞的深入表型显示了几种能够帮助B细胞的蛋白质的表达，包括IL-21、CXCL13、ICOS和MAF，并将它们与传统的滤泡辅助T细胞区分开来，而下游的机制实验证明了这一群体促进浆细胞分化的能力。在另一项相关的研究中，用质谱流式分析了RA患者和骨关节炎对照者的外周血。研究发现RA患者有一个扩大的效应记忆CD4 T细胞群，显示CD27 HLA-DR表型，表明这些细胞在RA中的慢性激活。
2019年，有研究为了确定驱动类风湿性关节炎（RA）的细胞群，将单细胞RNA测序（scRNA-seq）、Bulk-RNA测序和质谱流式技术应用于51个滑膜组织样本（图3），利用基于5,265个scRNA-seq谱的典型相关分析的综合策略，确定了18个独特的细胞群。将质谱流式技术和转录组学数据结合，文章发现RA滑膜中的细胞状态变化： THY1(CD90)+HLA-DRAhi底层成纤维细胞、IL1B+促炎症单核细胞、ITGAX+TBX21+自身免疫相关的B细胞和PDCD1+ T外周辅助细胞（Tph）和T滤泡辅助细胞（Tfh）。文章也定义了以GZMK+、GZMB+和GNLY+表型为特征的CD8 T细胞亚群。
图3. 质谱流式细胞术类风湿性关节炎（RA）患者样本实验流程概述
2、病毒感染
病毒（Virus）是一类非细胞形态的微生物。主要有以下列基本特征：个体微小，仅具有一种类型的核酸，或DNA或RNA；严格的活细胞（真核或原核细胞）内复制增殖；具有受体连结蛋白(receptor binding protein)，与敏感细胞表面的病毒受体连结，进而感染细胞。病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制（Replication）”。病毒复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤，又称复制周期(Replication cycle)。
机体抗病毒感染免疫应答包括非特异性免疫与特异性免疫。前者指获得性免疫力产生之前，机体对病毒初次感染的天然抵抗力，主要为单核吞噬细胞、自然杀伤细胞及干扰素等的作用。后者指抗体介导的和细胞介导的抗病毒作用。质谱流式和高维分析工具能够深入评估病毒感染重塑的特定宿主抗原，并揭示了感染细胞的特征，使它们能够存活和持续存在，以及可以响应并可能控制病毒复制的免疫细胞。因此，质谱流式在HIV，新冠，乙肝，带状疱疹等多种病毒感染研究中发挥重要作用（图4）。
图4. 质谱流式细胞术CyTOF在HIV研究中的应用
为了表征对HIV感染的易感性，有研究通过单细胞质谱流式术对受感染的扁桃体T细胞进行表型分析，并创建了全面的图谱，以确定CD4+ T细胞的哪些亚群支持HIV融合和生产性感染。通过降维、聚类和统计方法来比较HIV融合和HIV感染的细胞，以解释病毒扰动，研究确定了帮助HIV进入机体但不支持病毒基因表达的记忆CD4 + T细胞子集，这些细胞表达高水平的 CD127（IL-7 受体），被认为是长寿的淋巴细胞。在HIV感染患者中，表达CD127的细胞优先定位于病毒复制有限的滤泡外淋巴系统区。基于CyTOF的表型与区分选择性感染和病毒受体调节的分析方法相结合，可以用作病毒检测工具（图5）。
图5. 质谱流式细胞术CyTOF对组织CD4 + T细胞的HIV进入和生产性感染进行了全面表征
CyTOF不仅可以对生产性感染的细胞进行详细分析，还可以对未经历生产性感染的细胞进行研究，包括优先被HIV杀死的细胞。通过评估感染结束时哪些细胞缺失，同时通过PP-SLIDE进行感染相关的重塑，发现CD4 + Tm细胞的一些亚群对生产性感染的敏感性相对较低，对CXCR4热带HIV诱导的细胞死亡非常敏感。这些细胞可以通过HIV共受体CXCR4的高表达、中药表型（CCR7+CD62L +）以及检查点分子（PD1、CTLA4）和活化标志物（CD69、CD25、HLADR）的低表达来定义。相比之下，对HIV诱导的细胞死亡具有低表达的CXCR4，Tem表型（CCR7-CD62L-）和检查点/活化标志物（PD1，CTLA4，CD69，CD25和HLADR）的高表达。这些数据表明，最容易受到HIV感染的细胞不一定是最容易受到HIV诱导的细胞死亡的细胞，并提供了对HIV流产或旁观者杀死的机制的见解（图6）。
图6. 质谱流式细胞术优先杀死与优先感染的CD4 Tm亚群的深度表型
对于COVID-19感染，目前已有超过一百篇文献报道了使用了质谱流式进行研究的结果。为了确定细胞和分子水平上免疫反应元件的哪些特定改变与SARS-CoV-2有关，有研究从19名无症状和12名有症状的SARS-CoV-2pos受试者、47名年龄/性别匹配的轻度或中度COVID-19患者和27名正常受试者中获取血样，并使用44-plex CyTOF、RNA-seq和Olink的联合检测方法对他们进行研究（图7）。研究表明无症状和有症状的受试者都表现出许多易于检测的免疫学改变，包括CD107alow经典单核细胞、中间单核细胞、非经典单核细胞和CD62Lhi CD8+T幼稚细胞的频率显著下降，血浆STC1水平降低，但CD4+ NKT细胞的频率增加。相互关系分析显示了一种特殊的症状前免疫类型，主要表现为单核细胞过度活化和分化受阻，这可能是感染引起的淋巴细胞衰竭和免疫抑制。
图7. 质谱流式细胞术和RNA-seq并行分析单个PBMC样品，并通过Olink蛋白质组学分析相应的血浆样品
除了感染前后的免疫学特征，质谱流式还可以测定灭活疫苗诱导的机体免疫学特征。有研究监测和分析了接受三剂疫苗的受试者的抗体效力和强化注射所引起的抗体反应。该研究在一个多中心合作中进行，招募了360名20-74岁的健康成年人。参与者在0、1和7个月时接受了国药集团/BBIBP COVID-19灭活疫苗的第一、第二和加强剂量的注射。在多个时间点监测疫苗诱导的病毒特异性抗体水平（SARS-COV-2-IgA/IgM/IgG），代用病毒中和试验（sVNT），并在接种前和第二剂后一个月使用CyTOF方法分析免疫细胞和标志物的空间分布和比例。CyTOF数据显示了抗体的活跃产生和免疫环境的变化。
3、衰老
理解衰老和寿命限制的机制一直是生物学家面临的挑战。衰老是细胞不可逆地停止分裂并进入永久性生长停滞状态而不经历细胞死亡的过程。 未修复的DNA损伤或其他细胞应激可诱发衰老。衰老与各种各样的生理变化有关，不仅与死亡相关，而且限制了机体的正常功能，也与多种疾病的发生相关。
有研究使用高维单细胞质谱流式技术解析人CD8 + T细胞随着衰老的改变。纹藏使用CyTOF分析了年轻（年龄≤35岁）和老年（年龄≥65岁）成年人中与细胞活化/迁移以及定义幼稚型和记忆型T细胞亚群有关的24个分子的表达，这些分子的任何差异性表达都可能影响细胞功能和随后的免疫反应。老年人的分子表达水平有所改变，包括CD45RA、CCR7、CD62L和CD27。在老年人中具有记忆细胞表型的CD8 T细胞亚群扩大，而具有幼稚细胞表型的CD8 T细胞亚群减少（图8）。免疫检查点分子PD-1和TCR信号调节器CD5以及趋化因子受体CCR2、CXCR6、CCR4和CXCR4在不同年龄人的CD8 T细胞中的表达有差异。这些发现表明，CD8 T细胞的激活和迁移通过这些分子发生了与年龄有关的改变。
图8. 质谱流式细胞术揭示CD8 T细胞的多维特征随年龄而变化
质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：
单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。
生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。
细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。
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