药物开发和生物制品表征：质谱流式可检测的细胞指标-百泰派克生物科技BTP

质谱流式技术（Mass Cytometry）在药物开发和生物制品表征中的潜力巨大。质谱流式细胞术将质谱技术与流式细胞仪相结合，能够实现对单个细胞的生化成分进行深入研究，帮助我们理解疾病机制，验证药物的效果，发现新的药物靶点以及增强生物制药质量控制。这在生物制品表征中非常有用，它可以帮助解决以下一些问题：

单细胞层次的分子表征：传统的质谱技术通常需要大量的样本以获取可靠的结果，而质谱流式技术则可以分析单个细胞的生化成分，这可以帮助我们更深入地理解细胞的生物学特性。

生物分子的定量分析：质谱流式技术可以对细胞内的生物分子进行定量分析，包括蛋白质、代谢物和其他生物分子。

细胞异质性的研究：细胞群体中的细胞并非完全相同，它们之间的差异可能影响疾病的发展和治疗的效果。质谱流式技术可以帮助我们研究这种细胞异质性。

百泰派克生物科技BTP采用基于Fluidigm Helios流式细胞仪（Mass Cytometry System for Single Cell Analysis）用于单细胞质谱分析，该平台能够完成包括单细胞捕获、cDNA合成、实时定量PCR分析、目标区域扩增以及质谱流式细胞分析。

相比于传统荧光流式，质谱流式的检测指标完成了从荧光标签到金属标签的巧妙转换。检测维度的递增代表了一种突破性的进展，这使得质谱流式具有独特的优势，目前，使用质谱流式技术可以同时对多达45个参数进行可靠的量化。理论上，质谱流式能同时对100多种元素进行检测，这表明在未来的应用中具有更高的复用能力，这使得质谱流式能够更全面的方式对细胞进行分析。

目前质谱流式可检测的细胞指标可分为12类，2020年有一篇综述全面的总结了质谱流式的应用领域。

1、表型特征分析

质谱流式可以复用多达45个细胞标记物，开辟了一个后荧光时代的细胞测量法，非常适合对复杂系统中的细胞进行深度表型分析。在疾病发病机制中发挥不同作用的高相似程度细胞可以用质谱流式进行进一步区分，对个性化医疗有重要意义。由于能够通过金属抗体标记并探测几乎所有细胞表面分子，质谱流式可以描述各种细胞类型，包括免疫细胞谱系中的稀有细胞。

2、细胞内细胞因子测定

细胞因子的表达水平提供了关于免疫激活状态的新视角。质谱流式较高的多参数能力使其能够提供细胞分型和胞内细胞因子表达的多重信息。Vendrame等人利用CyTOF评估了细胞因子对自然杀伤（NK）细胞的影响，发现白细胞介素（IL）-12/IL-15/IL-18的刺激诱导NK细胞中干扰素-γ（IFN-γ）的表达急剧增加。Doyle等人对丙型肝炎病毒（HCV）感染患者的肝脏和外周血中的浆细胞（pDCs）进行了表征，并证明在慢性HCV感染期间，肝脏pDCs是多功能的，能够产生丰富的IFN-γ和其他免疫调节剂。

3、细胞内信号传递状态

细胞内的多种信号通路可以感知环境刺激并做出相应地调整，以实现关于细胞反应的关键决策。使用针对磷酸化蛋白的金属螯合抗体，质谱流式可以表征单个细胞内的信号通路状态。已有研究证明了质谱流式在评估细胞信号传导状态的动力学或时间点方面的效用。Shinko等人提供了一个优化的临床血液样本磷酸化信号蛋白的染色方案。结合细胞类型标志物和刺激/抑制状态，可以全面的评估细胞内信号传导状态和细胞对特定条件的反应特征。

4、细胞体积和大小的测量

细胞大小和体积是对于细胞类型的基本表征指标。荧光流式细胞仪利用散射光指标（前向散射光和侧向散射光）来确定细胞体积和大小。Stern等人建立了基于小麦胚芽凝集素（WGA）和基于锇四氧化物（OsO4）的质膜染色来衡量哺乳动物细胞的大小。Rapsomaniki等人确定钌复合物ASCQ_Ru是量化细胞体积的有力标记。这些染色剂替代了荧光流式细胞仪中评估的光散射特性，扩大了质谱流式技术的可检测参数范围。

5、细胞活力的鉴别

辨别细胞活力在生物样本分析中至关重要，特别是在功能研究中，如细胞内信号传递或药物反应。传统流式中PI、DAPI、7-AAD等DNA染料区分出死细胞。在质谱流式技术中，顺铂（Cisplatin）被用来标记细胞死活，原理死细胞的细胞膜不完整，顺铂会优先标记死细胞，与其DNA结合。

6、细胞周期鉴定

细胞周期的改变是肿瘤进展、发育生物学和免疫调节的重要方面。传统流式通常使用使用碘化丙啶（PI）等DNA染料来进行细胞周期分析。Behbehani等人开发了一种新的质谱流式方法来划分细胞周期阶段，基于碘脱氧尿苷（IdU）来标记S期的细胞，再加上针对磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）、细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、细胞周期蛋白A（cyclin A）和磷酸化组蛋白H3（pHH3）的抗体来定义G0、G1、G2和M期。利用这种方法，研究发现细胞周期差异介导了急性骨髓性白血病的化疗敏感性和端粒酶敲除小鼠的红细胞生成障碍。

7、细胞增殖追踪

传统流式通常使用CFSE，BrdU，EdU来进行细胞增殖分析。在质谱流式技术中，Good等人使用金属标记的抗异硫氰酸荧光素抗体来追踪CFSE信号的变化。分裂的细胞将一半CFSE信号传递给单个后代细胞，作为细胞分裂计数的表征。在这项研究中使用了23种标记物和增殖指标来标记单个幼稚的人类T细胞，建立了幼稚T细胞扩增过程中的细胞变化图。

8、受体占有率测定

单个细胞上药物结合的受体与总受体的比率被称为受体占有率，它是治疗性单克隆抗体的生物标志物。Punet-Ortiz等人监测了19名接受纳他利珠单抗治疗的多发性硬化症患者外周血单核细胞（PBMCs）的CD49d受体占有率，并进行了6个月的随访。他们用这个CD49d受体占有率的指标来确定安全的个性化治疗方案，并提出了一个优化的基于质谱流式技术的受体占有率测量方案。质谱流式能以更可靠和可重复的方式，在多种细胞类型中与更多标记物一起测量受体占有率，这在药物药效学或免疫抑制领域具有极大的应用潜力，可以取代传统的荧光流式细胞仪。Huse等人强调了通过质谱流式测定受体占有率扩大了临床细胞测量的仪器范围，并介绍了三种基于质谱流式的受体占有率测定的基本方法。

9、基于四聚体的抗原特异性T细胞筛选

为了更好地开发自身免疫性疾病和癌症的疫苗和靶向药物，需要对认知特异性抗原和与抗原结合的T细胞的结合亲和力进行全面的描述。利用改良的肽-MHC I类四聚体与金属螯合聚合物结合的方法，可以利用质谱流式进行多维分析。利用结合组合染色的方法，Newell等人同时测试了癌症中的数百种新抗原。在阿特佐珠单抗治疗前后的14例非小细胞肺癌患者群中，用高度复用的组合四聚体染色法筛选了抗原特异性CD8+T细胞，结果表明，在阿特佐珠单抗治疗的应答者中，低分化的效应性新抗原特异性CD8+T细胞富集。但是T细胞受体和肽-MHC II之间的亲和力较低，且抗原特异性CD4+T细胞的频率较低，这也使得用质谱流式筛选肽-MHC II四聚体具有挑战性，经过优化后，目前已经在PBMCs和组织来源的细胞悬浮液中实现了肽-MHC II四聚体的染色。

10、染色质修饰分析

组蛋白修饰是蛋白质组表观遗传调节的基础。已有研究采用质谱流式来研究染色质修饰。Cheung等人提出用CyTOF（EpiTOF）进行表观遗传学景观分析，这是一种高度复用的形式来分析组蛋白修饰，建立了染色质标记操作的策略，如异位过表达或CRISPR或RNAi介导的染色质修饰酶耗竭，以验证和选择EpiTOF的抗体。两种能够识别总组蛋白的抗体被整合到EpiTOF中，用于对抗体背景、核表位可及性和组蛋白表达的变化控制。

11、RNA和蛋白质的编码检测

为了能够在单细胞分辨率下对RNA和蛋白质特征进行编码检测，Frei等人开发了PLAYR（proximity ligation assay for RNA），这是一种进行高度多重转录物定量的方法。当与质谱仪一起使用时，PLAYR允许对40多种不同的mRNA和蛋白质同时进行定量。PLAYR采用成对的DNA寡核苷酸探针，包括一个区域与目标转录物杂交，另一个区域作为模板与另外两个寡核苷酸结合并环化，通过滚动循环扩增进行连接和放大。每个探针对的扩增产物都用标记有质量标签的寡核苷酸来检测。另一种基于质谱流式的新型mRNA转录物和蛋白质编码检测方法，称为金属原位杂交（MISH），是通过结合CyTOF和RNAscope平台开发的。该技术通过杂交RNA特异性探针和与放大的序列靶向金属标记的探针结合实现信号放大。

PLAYR和MISH都与常规免疫染色兼容，同时进行的转录物定量数量只受限于可与寡核苷酸连接的报告基团的数量。值得注意的是，在这两种方法中，RNA的测量将占据金属通道，这意味着同时编码检测的RNA和蛋白质目标的总数取决于金属质量通道的数量（目前最多为45个）。Frei等人给出了一个蛋白质和转录物的同时多重分析的例子。他们用PLAYR监测脂多糖刺激后PBMCs中8个细胞因子转录物和18个蛋白表位的诱导，并揭示了每个细胞的功能能力和其蛋白标记物表达之间的相关性。

12、质谱流式成像

Geisen等人使用CyTOF对组织样本进行成像，以获得空间蛋白质组学，所提出的技术，即质谱流式成像技术（Imaging mass cytometry，IMC）。IMC使用分辨率为1 μm的激光烧蚀组织切片，产生气溶胶、经过雾化和电离后，由惰性气体流带至飞行时间质谱中进行检测。IMC被认为是一个里程碑式的发展，因为它可以同时分析多达50个参数，并与细胞相互作用和亚细胞分辨率的空间信息同步进行。自该项技术出现以来，IMC正被迅速在各个领域被应用。

参考文献：

[1] Zhang T, Warden AR, Li Y, Ding X. Progress and applications of mass cytometry in sketching immune landscapes. Clin Transl Med. 2020 Oct;10(6):e206. doi: 10.1002/ctm2.206. PMID: 33135337; PMCID: PMC7556381.