蛋白质分子量测定：你应该遵循的10个步骤（二）

蛋白质分子量（Molecular Weight, MW）是揭示其结构、功能和复合物组装状态的重要参数。无论是确认重组蛋白表达是否正确，还是验证蛋白复合体的亚基组成，准确的分子量测定都是关键步骤。本文将系统梳理蛋白质分子量测定的10个核心步骤，帮助科研人员优化实验设计，提高数据准确性。

 

第一步：明确测定目的与蛋白特性

不同实验目的（如验证表达、筛选修饰、研究相互作用）对应不同测定策略。建议提前了解蛋白的理论分子量、是否含有标签、预期的聚集状态，以及是否可能存在糖基化、磷酸化等修饰。

 

第二步：选择合适的测定方法

常见蛋白质分子量测定方法包括：

• SDS-PAGE：基于电泳迁移率估算蛋白分子量，适合初筛和表达检测，但对修饰蛋白或聚合体存在一定误差。

• 凝胶过滤色谱（SEC）：适用于分析蛋白的聚集状态或复合物组成，若结合多角度光散射（MALS）可提高分子量评估准确性。

• 质谱法（MS）：具备高灵敏度和高分辨率，适用于精确测定蛋白分子量，尤其在分析修饰、异构体或复杂蛋白方面优势显著。

在百泰派克生物科技，我们提供从SDS-PAGE初筛到高分辨质谱精确测定的一站式服务，满足不同研究需求。

 

第三步：蛋白样品的准备与纯化

高纯度的蛋白样品是精准测定的前提。建议采用Ni-NTA亲和纯化、SEC等方式去除杂蛋白，避免影响测定结果。对于质谱分析，需进一步脱盐、去除缓冲盐或甘油等干扰成分。

 

第四步：估算理论分子量

使用ExPASy ProtParam等在线工具，根据蛋白质氨基酸序列快速计算理论分子量（考虑标签与信号肽）。此值将作为实验结果的参照。

 

第五步：验证蛋白是否为单体

对于功能相关研究，判断蛋白是否以单体或复合物存在至关重要。可通过原位质谱、SEC-MALS 或冷冻电镜数据进行验证。

 

第六步：选择适配的质谱模式

• ESI-MS（电喷雾质谱）：适合大分子分析，灵敏度高。

• MALDI-TOF MS：适合高通量筛查，特别是在蛋白修饰筛查中应用广泛。

不同模式对样品浓度、缓冲体系、带电状态有不同要求，建议根据蛋白特性调整上机参数。

 

第七步：优化仪器参数与上样策略

控制进样流速与浓度，避免多聚体干扰

• 对于LC-MS，使用低盐缓冲体系，适配LC柱类型

• 对于MALDI，选用合适的基质（如sinapinic acid）增强信号

 

第八步：数据解析与分子量计算

使用专业软件（如BioPharma Finder、MaxQuant、FlexAnalysis）进行谱图分析。对照理论分子量，判断是否存在修饰、降解、剪切等现象。

 

第九步：结果验证与交叉验证

建议使用两种以上方法进行交叉验证（如SDS-PAGE结合质谱），提高蛋白质分子量测定数据可靠性。特别是在新蛋白表达、结构生物学研究中尤为重要。

 

第十步：归档与数据标准化

将实验流程、参数设定、质谱原始数据和分析结果标准化归档，不仅便于后期重复实验，也有利于成果发表与专利申请。

 

科学、精准、可复现是关键，蛋白质分子量测定不仅是一个技术过程，更关乎研究的可靠性和可重复性。从实验设计到数据解读，每一步都值得严谨对待。在百泰派克生物科技，我们融合高分辨质谱平台（如Orbitrap、Q-TOF）与专业数据分析团队，为您提供高准确度的蛋白质分子量测定服务，支持从基础研究到新药开发的多维应用。

 

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