多肽消光系数测定
消光系数（extinction coefficient）是被测溶液对光的吸收大小值。被测溶液浓度高，溶液显色后颜色深，对光吸收大，光透射率低，反之就小。它也称为摩尔吸光系数（Molar Extinction Coefficient）,是指浓度为1摩尔/升时的吸光系数,ε表示,当浓度用克/升表示，比色皿的光程为1 cm时,摩尔吸光系数在数值上等于吸光系数与物质的分子量（M）之积,ε=αM。测定多肽的消光系数可以得到多肽浓度，多肽的紫外吸收主要来源于色氨酸 （Trp） 、酪氨酸 （Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等芳香族氨基酸残基。利用多肽序列中的色氨酸与酪氨酸在波长 280 nm 处的吸光度可以计算消光系数和浓度值。以下是一些常用的消光系数测定方法：
一、紫外分光光度法
紫外分光光度法是基于不同分子结构的物质对电磁辐射的选择性吸收而建立起来的方法，属于分子吸收光谱分析。当光通过溶液时，被测物质分子吸收某一波长的单色光，被吸收的光强度与光通过的距离成正比。可以对该物质进行定性和定量分析的方法。紫外分光光度法由于具有灵敏度高、操作简便、快速专属性强、抗干扰、操作简便等优点，被广泛应用于消光系数的测定。
图1. 紫外分光光度法流程图
二、透射光谱法
透射光谱法主要用于分析物质的光学性质、化学组成和结构等。透射光谱法的基本原理是，将通过样品的透射光通过光谱仪进行分光测量。一般来说，样品之前需要以适合的形式，比如溶解、粉碎或涂覆在透明的基底上，然后，将透过样品的光通过光谱仪接收，并测量不同波长下的光强度，根据不同物质的吸收特性，可以得到样品的透射光谱。透射光谱灵敏度高，分析速度快，不会破坏分析物，蛋挞也存在一些限制，比如对样品形态有一定要求，样品必须透明切足够波，此外，透射光谱法通常只能提供关于样品在透明区域的信息，对于非透明区域的分析不合适。
图2. 透射光谱法示意图
三、反射光谱法
反射光谱法的工作原理基于物质对光的反射和吸收特性。当光线照射在物质表面时，一部分光线被物质表面反射回来，剩余的光线则被吸收或穿透物质，这取决于光线和物质之间的相互作用。反射光谱测定吸光系数主要基于物质对光的反射和吸收特性。进行反射光谱测量时，需要确保光源的稳定性和一致性，以避免背景光的干扰，同时需要避免样品受到外界环境的影响。对于一些特殊的样品，可能还需要使用附加装置，如旋转台或各向异性样品支撑等，以获取更全面的信息。
图3. 反射光谱法原理图
四、红外吸收光谱法
物质是由不断振动的状态的原子构成，这些原子振动频率与红外光的振动频率相当。用红外光照射有机物时，分子吸收红外光会发生振动能级跃迁，不同的化学键或官能团吸收频率不同，每个有机物分子只吸收与其分子振动、转动频率相一致的红外光谱，所得到的吸收光谱通常称为红外吸收光谱，简称红外光谱（IR）。红外吸收光谱测定吸光系数主要基于朗伯-比尔定律，该定律描述了物质对光的吸收与浓度、光程长度以及吸光系数之间的关系。
图4. 红外光谱法原理图
测定多肽消光系数通常涉及一系列步骤，这些步骤主要是基于多肽中特定氨基酸残基（如色氨酸和酪氨酸）在特定波长（如280 nm）下的吸光度。以下是测定多肽消光系数的一般步骤：
1. 准备多肽溶液：首先，需要准备待测定的多肽溶液。这个溶液应该是纯净的，并且浓度应该是已知的或可以准确测量。
2. 确定发色团残基： Trp 和 Tyr 残基是多肽中的发色团，它们在紫外光区域（主要是280 nm附近）有强烈的吸收。因此，需要确定多肽序列中这些残基的数量和类型。
3. 测量吸光度：使用紫外可见分光光度计，在280 nm波长下测量多肽溶液的吸光度。这可以通过将多肽溶液置于1厘米的光程比色皿中完成。
4. 计算摩尔消光系数：使用吸光度值、多肽浓度、稀释因子（如果需要的话）以及发色团残基的摩尔消光系数（ Trp 通常为5560AU/mmol/mL，Tyr为1200AU/mmol/mL）来计算多肽的摩尔消光系数。这通常涉及使用公式，如 mg 肽/mL= (A280 x DF x MW)/e，其中A280是溶液在280 nm处的实际吸光度，DF是稀释因子，MW是多肽的分子量，e是每个发色团在280 nm处的摩尔消光系数。
虽然这种些法可以提供多肽消光系数的近似值，但实际的消光系数可能受到多种因素的影响，包括多肽的构象、溶剂的选择以及实验条件的变化等。因此，在使用这些结果时，需要谨慎考虑这些因素。
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