糖基化分析之糖基化位点分析

蛋白糖基化是一种在生物体内发生的过程，通过糖基转移酶的作用，糖类化合物与蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键，从而将糖类化合物连接到蛋白质上。这个过程开始于内质网，然后在高尔基体结束。经过糖基化修饰的蛋白质被称为糖蛋白。

糖基化对生物制品的疗效、稳定性和免疫原性有着重要的影响。其中，寡糖谱和糖链结构是评估生物制品特性的关键指标。作为重要的碳水化合物，寡糖参与蛋白质折叠和信号传导等多种细胞生命过程。此外，它们还经常与蛋白质结合形成糖蛋白。糖蛋白常位于细胞表面，参与细菌和病毒的识别以及凝集素等其他蛋白质的相互作用，对于生物制品的正常功能至关重要。

寡糖是非模板合成的，并具有树状结构，这增加了寡糖结构解析的挑战。为此，百泰派克生物科技BTP开发了一系列稳定、高效的液相色谱高分辨质谱（LC-MS/MS）表征方法。这些方法涵盖了从糖链分析到糖基化位点鉴定，再到糖肽解析的完整分析流程。通过这些方法，我们能够有效地研究和解析寡糖的结构和功能特性。糖基化分析基本流程图如下所示。

图1 糖基化分析流程图

一、生物制品N糖基化位点分析

1.原理

通过在重水中使用PNGase F来释放糖链并标记18O的方法，可以实现N-糖基化位点分析。首先，根据蛋白质的理论氨基酸序列信息，选择适当的蛋白酶将蛋白质切割成肽段。待溶剂挥发后，我们在重水中进行切糖处理。然后，通过液相色谱-高分辨质谱技术，我们能够确定带有18O修饰的N-糖基化位点所在的肽段，从而确定N-糖基化的位置。通过比较修饰和未修饰肽段的质谱峰积分面积，我们还能够确定该糖基化位点的修饰效率。这些分析方法可以帮助我们深入研究和了解蛋白质的N-糖基化修饰。

2.实验仪器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos

3.实验结果展示

图2 N糖基化位点二级图

注：图中N糖基化修饰在肽段第八位氨基酸上，分子量变化为+2.988，横坐标为质荷比，纵坐标为信号强度

二、生物制品O糖基化位点分析

1.原理

我们采用直接分析O糖肽的方法，进行O-糖基化位点分析。首先，根据蛋白质的理论氨基酸序列信息，选择适当的蛋白酶将蛋白质切割成肽段。然后，通过液相色谱-高分辨质谱技术采集质谱原始数据。将这些数据导入O糖数据库，将O糖修饰作为可变修饰加入到数据分析中。最终，确定蛋白质中哪些位点发生了O糖基化修饰。通过这种分析方法，我们能够准确地确定O糖基化位点，从而深入研究蛋白质的糖基化修饰特征。

2.实验仪器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos With ETD

3.实验结果展示

图3 O糖基化位点二级图

注：图中O糖基化修饰在肽段第五位氨基酸上，分子量变化为+365.132，横坐标为质荷比，纵坐标为信号强度

常见问题

问题1：如何在重水切糖中确定N-糖基化位点？

回答：N-糖基化位点是指发生N-糖基化修饰的氨基酸位点，该位点氨基酸的-NH2与N糖链的-COOH发生反应形成酰胺键。在重水切糖的过程中，PNGase F酶会切断N-糖基化位点与糖链之间的酰胺键。然后，重水中的-18O将与N-糖基化位点的氨基酸上的-NH2基团连接，从而完成对N-糖基化位点的标记。

问题2：糖基化通常发生在哪些氨基酸上？

回答：N-糖基化通常发生在天冬氨酸残基上，而O-糖基化通常发生在丝氨酸和苏氨酸残基上。这些氨基酸的特定位置在蛋白质的氨基酸序列中决定了它们是否容易发生糖基化修饰。