超速离心法测定蛋白质分子量：方法、策略和现状

蛋白质分子量测定是研究其结构、功能和生物学特性的重要手段。超速离心法（Ultracentrifugation）是基于离心力和溶液动力学特性的测定方法，在研究蛋白质的分子量、聚集状态和相互作用方面发挥关键作用。与SDS-PAGE、质谱和凝胶过滤等方法相比，超速离心法可以直接在溶液中测量蛋白质的真实分子量，且不依赖于外部标准。本文将深入探讨超速离心法的原理、实验策略、数据分析方法及其在蛋白质研究中的最新应用。

 

一、超速离心法的基本原理

超速离心利用高速旋转产生的离心力，使蛋白质在溶液中发生沉降，进而根据沉降速率或沉降平衡来计算其分子量。常见的测定方式包括：沉降速率分析（Sedimentation Velocity, SV）和沉降平衡分析（Sedimentation Equilibrium, SE）。沉降速率分析研究蛋白质在离心过程中随时间变化的沉降行为。适用于分子量测定、均一性评估及蛋白质聚集状态分析。沉降平衡分析则研究蛋白质在达到沉降平衡时的浓度分布。适用于高精度蛋白质分子量测定、检测蛋白质-配体结合及寡聚体分析。

1、沉降速率分析（SV）

沉降速率实验通过测量蛋白质在高速离心下的沉降系数（sedimentation coefficient, s），从而计算其分子量。沉降系数的计算公式为：

​

其中：

• s：沉降系数（Svedberg，S）

• v：沉降速度

• ω：角速度（rad/s）

• r：颗粒到旋转轴的半径

 

（1）数据分析

• 通过Lamm方程（描述沉降和扩散的数学模型）对沉降曲线进行拟合，从而计算分子量。

• 结合密度梯度离心，可以区分不同分子量的蛋白质。

（2）应用

• 检测蛋白质聚集状态：可以区分单体、二聚体或更高聚体的蛋白。

• 测定蛋白复合物的组成：可用于研究蛋白-蛋白或蛋白-核酸相互作用。

 

2、 沉降平衡分析（SE）

沉降平衡实验是一种无破坏性、热力学原理驱动的方法，可用于测定蛋白质的真实分子量，无需外部校准标准。其核心在于达到平衡状态时，沉降力与扩散力相互抵消，蛋白质在溶液中的浓度分布符合以下公式：



其中：

• M：蛋白分子量

• vˉ：蛋白质的比偏摩尔体积

• ρ：溶液密度

• ω：角速度

• r：离心半径

• T：温度

• R：气体常数

 

（1）数据分析

• 通过测定平衡时的浓度梯度，利用非线性拟合方法测定蛋白质分子量。

• SE 能够区分不同寡聚体状态（如单体、二聚体、三聚体等），但不适用于高度聚集的样品。

（2）应用

• 高精度测定分子量：比SV方法更准确，适用于研究蛋白质的真实大小。

• 蛋白质复合物分析：可用于研究弱相互作用的蛋白质复合体，如DNA结合蛋白、抗体-抗原复合体等。

 

三、超速离心法实验策略及关键技术参数

1、样品制备

（1）缓冲液选择：避免高盐浓度，以防影响沉降行为。

（2）样品纯度：蛋白质应高度纯化，否则杂质会干扰分析。

（3）浓度范围：通常为 0.1-1 mg/mL，浓度过高会影响测量精度。

 

2、运行参数

（1）离心速度：SV 一般 40,000-60,000 rpm，SE 通常 10,000-20,000 rpm。

（2）温度控制：通常在 4°C 或 20°C 运行，以保持蛋白稳定性。

（3）检测方法：主要使用 紫外吸收（UV 280 nm） 或 干涉光学检测 记录数据。

 

四、超速离心法在蛋白质分子量测定中的应用

1、研究蛋白质的天然构象

SE可用于确定蛋白是否在溶液中保持天然单体状态，还是形成了二聚体、四聚体或更高聚体。例如，某些蛋白（如P53）在不同条件下会发生寡聚化，超速离心可检测这一现象。

 

2、解析蛋白质复合物

用于研究蛋白质-蛋白质或蛋白质-小分子相互作用，例如抗原-抗体复合物、蛋白酶-抑制剂相互作用等。

 

3、测定糖蛋白的真实分子量

由于糖蛋白的糖基化修饰会影响SDS-PAGE测定的分子量，SE可以提供其真实的无糖基化蛋白部分的分子量。

 

4、研究蛋白质稳定性

通过监测沉降系数的变化，可评估蛋白质是否发生变性、解离或聚集。

 

五、超速离心法的优势与局限性

1、优势

（1）无标记、非变性：不需要染料或变性试剂，可直接测量蛋白质的天然状态。

（2）高精度：SE法可提供接近真实值的分子量测定。

（3）可研究蛋白质相互作用：能分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸复合体的稳定性。

 

2、局限性

（1）仪器昂贵：超速离心机价格较高，且操作需要专业培训。

（2）实验耗时较长：SE 实验通常需要 12-48 小时。

（3）数据分析复杂：需要专业的软件（如 SEDFIT、SEDFIT-MSTAR）进行拟合计算。

 

超速离心法是一种高精度、非破坏性的蛋白质分子量测定方法，广泛用于蛋白质结构研究、蛋白质-配体相互作用分析及药物开发。随着计算机拟合技术和新型超速离心仪器的发展，该技术将在蛋白质研究领域发挥更重要的作用。此外，与光散射（MALS）、等温滴定量热法（ITC） 等方法的结合，将进一步提高蛋白分子量测定的准确性和广泛适用性。百泰派克生物科技公司以其前沿的技术平台，为客户提供高效的超速离心法测定蛋白质分子量服务。我们致力于通过精准的数据分析，帮助客户揭示蛋白质的生物学功能，欢迎有相关需求的科研人员与我们联系，共同探讨与创新。

 

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